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키타케 T-DNA 삽입계통 분석과 개화시기 조절인자에 관한 연구

Study on T-DNA insertional lines and flowering-time regulators in Kitaake

김송림 (Song Lim Kim, 포항공과대학교)

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벼는 단자엽의 모델식물로서 게놈의 크기가 380 Mb로 밀과 옥수수에 비해 매우 작은 편이며, 게놈의 염기서열 분석이 완료되어 분자 생물학적 연구재료로써 활발이 이용되고 있다. Brachypodium 역시 단자엽의 모델식물로써 제시되었지만, phylogenetic tree 상에서 봤을 때 작물과는 거리가 먼 유연관계를 가졌다. 또한, 대부분의 모델벼는 중만생종으로써 개화시기가 약 120-150일 정도로 매우 늦고, 생장실과 온실 조건에서 병충해와 강한 빛에 매우 약한 특징을 가지고 있다. 이와 같은 여러 문제점들은 단자엽의 새로운 ...
벼는 단자엽의 모델식물로서 게놈의 크기가 380 Mb로 밀과 옥수수에 비해 매우 작은 편이며, 게놈의 염기서열 분석이 완료되어 분자 생물학적 연구재료로써 활발이 이용되고 있다. Brachypodium 역시 단자엽의 모델식물로써 제시되었지만, phylogenetic tree 상에서 봤을 때 작물과는 거리가 먼 유연관계를 가졌다. 또한, 대부분의 모델벼는 중만생종으로써 개화시기가 약 120-150일 정도로 매우 늦고, 생장실과 온실 조건에서 병충해와 강한 빛에 매우 약한 특징을 가지고 있다. 이와 같은 여러 문제점들은 단자엽의 새로운 모델 식물을 필요로 하였다. 본 연구에서 나는 단자엽의 새로운 모델 식물로써 조생종인 키타케 품종의 특성 및 개화시기 조절 메커니즘을 밝히고, 키타케로부터 만들어진 T-DNA 삽입 변이체들의 특성 및 활용에 대해 논의하고자 한다. 키타케는 조생종으로써 장일 조건에서 중만생종인 동진보다 약 한 달 정도의 빠른 개화시기를 보이며, 조직배양이 용이하였다. 또한 내냉성과 스트레스에 대한 저항성이 높아 새로운 모델 식물로써 가치가 높았다. 빠른 개화시기와 내냉성은 추운 겨울의 온실 조건에서도 생장이 용이하였다. Rice Functional Genomic Express Database (RiceGE, http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)에는 여러 품종에 의해서 만들어진 약 319,969의 flanking sequence tags (FSTs)가 존재하였다. 한국의 POSTECH이 106,100 FSTs, 일본의 NIAS Tos17 insertion mutants가 77,701 FSTs, 대만의 Rice Mutant Database (RMD)가 47,231 FSTs 등이 존재하는데, 이 중 키타케는 약 6,758개의 FSTs에 의해 만들어진 약 10,000개의 T-DNA 삽입 변이체를 포함시켰다. 나는 RICE GE database로부터 약 319,969개의 FSTs를 얻었고, 키타케의 T-DNA 삽입 유전자와 비교하여 367개 (11.8%)가 새로운 유전자에 삽입 되었다는 것을 알게 되었다. 키타케에 삽입된 T-DNA 중 genic region에 들어간 것들은 염색체의 euchromatin 영역에서 많이 삽입되었고, centromere에서 가까운 heterochromatin 영역일수록 삽입빈도가 감소한다는 것을 알 수 있었다. 이것은 KOME full-length cDNA 분포와도 유사하게 삽입되었다. 키타케 T-DNA 삽입 계통들은 pGA2715 벡터에 의해서 만들어졌으며, 이들은 T-DNA가 insertion된 조직이나 기관에서 GUS 발현을 조사할 수 있도록 제작되었다. 나는 키타케 T-DNA 삽입계통의 GUS 발현 효율을 조사하기 위해 Genic region에 삽입된 3,122개 T-DNA inserts 중 Genomic DNA 안에 GUS가 정방향으로 삽입된 1,213개를 분석하였다. GUS-positive lines의 GUS 발현 빈도는 exons에서 21.4%, introns에서 15.7%, 5’-UTR에서 13.0%를 보였다. 이들은 특히 exon에 삽입된 계통들에서 상대적으로 높은 빈도의 GUS 발현 효율을 보였다. pGA2715 형질전환 벡터는 promoterless GUS 앞에 triple splicing donor와 acceptor가 존재하여 식물체의 genomic DNA 안으로 T-DNA가 어떤 방향으로 삽입되더라도 일정하게 splicing pattern을 가지도록 하였다. GUS positive lines을 조사해 본 결과, 이들은 exon에 삽입된 T-DNA들은 첫 번째 splicing acceptor와 세 번째 splicing donor를 사용하였고, intron에 삽입된 경우는 첫 번째 splicing acceptor와 T-DNA가 삽입된 곳의 인근 exon의 splicing donor를 사용하여 splicing이 일어난 것을 알 수 있었다. 이것은 키타케 삽입 계통의 활용에 효율적으로 이용될 것이다. 키타케의 개화 관련 메커니즘 연구는 이들을 활용한 유전체 연구에 가장 우선시 되는 일이다. 나는 개화 관련 유전자들의 발현과 염기 서열 비교로 키타케의 조기 개화 유전인자들을 조사하고자 하였다. 키타케는 중만생종인 동진과의 비교에서 장일조건에서 개화신호의 하위 유전자에 해당되는 Ehd1, Hd3a, 그리고 RFT1과 같은 개화 촉진인자들은 모두 증가하였다. 또한, Se5, OsphyA, OsphyB, OsphyC와 같은 photoreceptor들은 키타케와 동진 사이에 발현 차이를 보이지 않았다. OsMADS50, Ehd3, OsELF3와 같은 개화 촉진인자와 OsCOL4와 Hd1과 같은 OsCOL family들 역시 차이를 보이지 않았다. 하지만, Ghd7/Hd4은 키타케에서 동진보다 크게 감소한 것을 알 수 있었다. Ghd7은 개화 억제인자로써 CCT-domain-containing protein을 가진 OsCOL family에 해당되었다. Ghd7은 Zenshan97 (zs7)과 Minghui 63 (mh7) 사이의 Near isogenic lines (NILs)을 통해 개화시기, 키, 생산량을 증가시키는 유전자로 알려져 있었다. 2008년 Xue 등은 non-functional한 Ghd7 alleles인 Ghd7-0과 Ghd7-0a를 보고하였다. Genomic DNA sequencing을 통해서 키타케의 Ghd7은 53번째 아미노산의 glutamate (E, GAG)가 stop codon (TAG)로 바뀌어 early termination된 것을 알 수 있었다. 동진은 Nipponbare와 같은 functional한 allele을 가진데 반해, 키타케는 non-functional한 Ghd7-0a type을 가지고 있었다. 하지만, 동진에 비해 키타케의 Ghd7 발현 감소는 Ghd7의 상위 유전자가 영향을 끼쳤을 것이라 추정하였고, Ghd7 상위에서 작용할 것으로 예상되는 OsGI, Ehd3, OsELF3, Se5, OsphyA, B, C에 대한 genomic DNA sequencing을 수행하였다. 하지만, 이들 사이에 특이점을 찾을 수 없었다. 이미 알려진 Hd2-QTL은 OsPRR37 유전자와 가깝게 위치해 있으며, 개화억제 인자로 알려져 있었다. OsPRR37은 동진과 키타케 사이에 발현 차이를 보이지 않았지만, genomic DNA sequencing 결과에 의하면, 키타케는 다섯군데에 변이가 존재하였는데, 특히 CCT domain에 해당되는 710aa에서 leucine (CTG)이 proline (CCG)으로 바뀐 것을 알 수 있었다. CCT domain은 이미 개화 시기를 조절하는 영역으로 보고된바 있었다. 나는 동진과 키타케 사이에 OsPRR37과 Ghd7이 Single nucleotide polymorphisms (SNPs)로 존재하여 개화시기를 조절했을 것으로 추정하였다. 나는 키타케의 조기 개화에 미치는 두 유전자의 영향을 조사하기 위해 키타케와 동진 사이의 124개의 F2 population을 만들었다. 이들은 SNP PCR을 통해 키타케와 동진의 Ghd7과 OsPRR37 alleles로 나눌 수 있었다. 키타케의 Ghd7과 OsPRR37 alleles에 의한 계통들은 키타케 Wild type과 유사하게 꽃이 피었다. OsPRR37 Knock-out (KO) mutants는 단일 조건에서는 개화가 지연되었고, 장일 조건에서는 개화가 촉진되었다. 단일 조건의 OsPRR37 KO mutants에서는 Wild type 보다 OsId1과 OsMADS51과 같은 개화 촉진인자들의 발현이 주로 감소하였고, 장일 조건에서는 Ghd7과 OsCOL4와 같은 개화 억제인자들의 발현이 주로 감소하였다. 이를 통해 OsPRR37에 변이가 생겼을 때 개화 관련 유전자들의 발현이 감소하여 광에 대한 민감도가 떨어졌다는 것을 알 수 있었다. 또한, photoreceptor 돌연변이체인 osphyb에서 OsPRR37은 장일 및 단일 조건에서 감소하였는데, 더욱이 OsphyA와 OsphyB의 double mutants에서는 좀 더 큰 감소를 보였다. 결과적으로 OsPRR37은 phytochromes 하위에서 광신호를 전달받아 신호를 증폭하였고, 이를 개화관련 유전자들로 전달한 것으로 보인다. 키타케는 해가 긴 조건에서 생장하기 위해서 개화 QTL인 Ghd7과 OsPRR37의 변이로 개화 촉진 및 광민감도를 감소시켰다. 결과적으로, 이번 연구는 키타케를 새로운 모델식물로써 제시하였고, 이들의 개화 매커니즘 제시는 다양한 생장 환경과 특성을 조사할 수 있었다. 또한 키타케 T-DNA tagging lines의 구축과 활용은 벼의 유전체 연구에 크게 이바지할 것으로 보인다.
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A model cultivar is needed to overcome the late flowering phenotype of rice to speed up research progress. Recently, Kitaake has been suggested as a model cultivar as it has a short life cycle due to early flowering phenotype. Expression analyses revealed that the transcript levels of the flowering ...
A model cultivar is needed to overcome the late flowering phenotype of rice to speed up research progress. Recently, Kitaake has been suggested as a model cultivar as it has a short life cycle due to early flowering phenotype. Expression analyses revealed that the transcript levels of the flowering repressor Ghd7 decreased while those of its downstream genes, Ehd1, Hd3a, and RFT1, increased in Kitaake compared to Dongjin. Sequencing of the known flowering-regulator genes revealed mutations in Ghd7 and OsPRR37 that cause early translation termination and amino acid substitutions, respectively. A genetic analysis of F2 progeny from a cross between Kitaake and Dongjin indicated that those mutations additively contribute to the early-flowering phenotype in Kitaake. As Kitaake is easily transformable, it can be used as a good material in functional genomics study. Our laboratory generated 10,000 T-DNA tagging lines in Kitaake. We deduced 6,758 flanking sequence tags (FSTs), of which 3,122 were genic and 3,636 were intergenic. To utilize Kitaake T-DNA tagged lines, I analyzed characters of Kitaake T-DNA tagging lines and GUS assay for functional genomics. I searched that among the genic lines, 367 (11.8%) were inserted into new genes that were not previously tagged. Because the lines were generated by T-DNA that contained the promoterless GUS reporter gene, which had an intron with triple splicing donors/acceptors in the right border region, a high efficiency of GUS expression was expected. However, The GUS positive frequency was much lower that expected value. Sequencing of the GUS-positive lines demonstrated that the third splicing donor and the first splicing acceptor of the vector were extensively used. To elucidate the function of OsPRR37, I analyzed an OsPRR37 knock-out (KO) mutant (osprr37). The osprr37 mutant flowered approximately 2 weeks later than the wild type under short-day (SD) conditions. By contrast, this mutant flowered approximately 10 days earlier than the wild type under long-day (LD) conditions. OsPRR37 primarily down-regulated the expression of flowering-regulatory genes that are expressed in the morning, but it did not alter the expression of evening-expressed genes or non-peak genes under SD or LD conditions. In addition, the regulation of morning-expressed genes by OsCCA1 was reduced in osprr37. These results suggest that OsPRR37 controls the expression of morning-expressed genes through OsCCA1, which opens up the possibility that OsPRR37 enhances the plant’s sensitivity to light signals in the morning. To elucidate the relationship between OsPRR37 and photoperiodic sensitivity, I analyzed the expression of OsPRR37 in phytochrome mutants. In the OsphyB and OsphyAB mutants, OsPRR37 expression was down-regulated under both SD and LD conditions. In addition, double mutants of OsphyA and OsphyB exhibited more effective down-regulation of OsPRR37. These results suggest that light signals are received by phytochromes, and these expressions are then transmitted to OsPRR37 to enhance photoperiodic sensitivity. Consequently, in the light-insensitive rice variety Kitaake, natural variations in OsPRR37 and Ghd7 expression may help the plant adapt to conditions present in northernmost regions by reducing flowering time and photoperiod sensitivity through regulating the expression of morning-expressed genes.
목차 moremore
Abstract----------------------------------------------------------------------------------ⅰ
Contents----------------------------------------------------------------------------------iv
List of Figures and Tables-------------------------------------------------------------vi
...
Abstract----------------------------------------------------------------------------------ⅰ
Contents----------------------------------------------------------------------------------iv
List of Figures and Tables-------------------------------------------------------------vi
Chapter 1. Introduction----------------------------------------------------------------1
1-1. Kitaake cultivars as a model plants -----------------------------------------------1
1-2. T-DNA tagging lines for rice functional genomics------------------------------1
1-3. Photoperiodic flowering------------------------------------------------------------2
1-3-1. Photoperiodic flowering in Arabidopsis------------------------------------3
1-3-2. Photoperiodic flowering in rice----------------------------------------------4
1-4. Objective------------------------------------------------------------------------------8

Chapter 2. Materials and Methods---------------------------------------------------9

Chapter 3. Analysis of the early-flowering mechanisms and characters of Kitaake T-DNA tagging lines as a model rice------------------------------------12
3-1. Results-------------------------------------------------------------------------------12
3-2. Discussions-------------------------------------------------------------------------21
3-3. Figures and Tables-----------------------------------------------------------------27

Chapter 4. OsPRR37 regulate flowering as an enhancer of photoperiodic sensitivity in rice------------------------------------------------------------------------51
4-1. Results-------------------------------------------------------------------------------51
4-2. Discussions-------------------------------------------------------------------------56
4-3. Figures and Tables-----------------------------------------------------------------60

Summary and Significance-----------------------------------------------------------70
References-------------------------------------------------------------------------------72
Summary in Korean ------------------------------------------------------------------90
Acknowledgement ---------------------------------------------------------------------96
Curriculum Vitae---------------------------------------------------------------------100